Bonjour j aimerai savoir a koi sert le PBS quand il est mis en presence de proteine?  

je vous detaille l experience:
 
donc on preleve 1ml de production de bacterie que l on centrifuge , on elimine le surnageant et on a joute au culot 150 µl de PBS et 50 µl de bleu et on fait chauffer le tt  3mn a 100°
 
Pourriez vous me dire a koi servent les differentes etapes tu protocole merci

 
ben c'est un tampon phosphate, à première vue il joue un rôle dans la solubilisation des protéines...

 
la centrifugation c'est pour séparer les bactéries du milieu de culture (qui se retrouve dans le surnageant).
Le PBS est vraiment ajouté seul? Pas en association avec du tween par exemple? Idem le bleu est il seul (comme marqueur lors d'une migration sur gel)?  
Parce que pour moi cette étape doit consister en la lyse des bactéries pour récupérer les bactéries intracellulaires. le chauffage ca favorise la lyse, mais je ne crois pas qu'un tampon phosphate seul puisse être un facteur de lyse.

il sert juste  a les  solubiliser ? mais en fait j ai des cellules bacteriennes intacte dans du milieu LB alors a koi setr la centrif + l elimination du surnageant+ l ajout de PBS sachant qu a la fin ce que je veux c est faire une electophorese pour voir si j ai ma proteine d interet

 
comme je le disais j'attendrais plus du PBS-Tween par exemple

 
Le PBS est ajouter seul et directement on ajoute le bleu ...le bleu sert effectivement de front de migration pour l eletropgorese...donc pour toi la lyse serait l etape de chauffage?

 
je plussoye

En fait j ai plusieur exprerience le but est de savoir si ma proteine d interet est soluble ou dans des corps d inclusion
Donc la premiere experience apparement c est proteine totale a la fois soluble et corps d inclusion .
Et a une autre experience je fais un traiement different
je centrifuge
j elimine le surnageant
j ajoute un produit
je centtrifuge
je recupere le surnageant +50µl de bleu dc apprement proteine soluble
et au culot 150µl de PBS +50µl de bleu proteine ds corps d inclusion
 
j aimerai savoir dans l experience proteine totale comment sont lyser la membrane des bacteries ? et comment sont recupere les proteines dans les corps d inclusion?
 
Et le role du PBs dans tt ca?

et aussi ou est la denaturation des proteines et est ce qu elle a un role avec les corps d inclusioN ?

tout ca est tres brouillon

alors personne sait?

 
Ca nous aide vachement ca  
A mon avis ton protocole est tres incomplet (et il serta quoi d'ailleurs?)
 
Sinon le PBS est simplement un "tampon adapte pour les proteines" (sans aucune necessite de detergent a la fin, mais bon une fois de plus ce protocole me semble plus qu'incomplet)

non mon protole est tout a fait complet
enfait c est le traitement d echantillons qui proviennent d une production de cellule bacterienne en milieu LB et le but est de voir sur eletrophorese si la proteine d interet est dans le surnageant ou dans le culot

D'accord (c'est vrai que c'est de la bacterie ton machin), donc je suppose que ton "produit" doit etre un detergent quelconque qui va solubiliser les membranes,  
Et que dans ton produit final culot=> "proteines membranaires"  
surnageant => "proteines cytoplasmique"
 
 
Donc une fois de plus, pour repondre a ta question, le pbs est simplement un tampon approprie pour la "conservation/stabilite" des proteines.
Maintenant, on pourrait savoir ce que tu fais avec?
Tu travailles pas en secret pour la secte aoum au moins?

 
je fais de l optimisation de production de proteine en systeme procaryote
dans le culot c est les proteine qui sont des les corps d inclusion comme elles sont insolubles? et dans le surnageant proteine soluble donc active?

 
Putain on a le meme projet ou quoi????
Quel type d'electrophorese derriere??

 
SDS page en discontinu et toi?

 
tu bosses ou?

 
Pareil. Mais Silver Stain powered . Sur quel proteine tu bosses??
 
Ah au fait, moua j'en mets pas de PBS, je mets du Tris-HCl. Et pour moi aussi c'est juste un tampon a la con (phosphate buffered qq chose..)

Je suis a l'universite d'oklahoma aux US donc, je bosse sur 4 proteines: GroEL minichaperone, La rotamase, DsbC et la horseradish peroxydase (HRP).

 
toxine botulique

 
       Dangereux ce truc la!!, Tu ne travailles pas pour des terroristes russes?? rassures moi..
 
T'as pas du SDS dans un de tes produits utilises?, si oui, lyse des cellules.

 
Alors la question que je pose depuis le debut c :
J aimerai qu on m explique a koi servent ttes les etapes de ce protocole sachant que mon but est de savoir si ma proteine est dans le surnageant ( dc soluble dc active) ou dans culot ( corps d inclusion dc insoluble dc inactve)
1ere experience
 
je centrifuge 1ml de la prodction
j elimine le surnageant
je reprends le culot avec 150µl de PBS +50µl de bleu
chauffe 3 mn a 100°
 
2 eme experience
 je centrifuge 1 ml de production
j elimine le surnageant
j a joute 150 µl de byg buster au culot
je retourne le tube 20 mn
je centrifuge
je recupere le surngeant + 50µl de belu
et au culot j ajoute 150µl de PBS +50µl de belu
je chauffe culot et surnageant 3 mn a 100°

 
non je travaille pas pour des terroriste russes je vais regarder si j ai du SDS mais en tt cas j en ai pas pour le traitement des echantillons

Byg buster connais pas.
 
Ben je ne vois que le chauffage pour expliquer la lyse des cellules, le PBS permet peut etre de solubiliser toute la merde.
 
DAns la deuxieme exp, le byg buster est peut etre un tampon de lyse, dans ce cas, le surnageant permet de voir la fraction soluble des prots et le culot la fraction insoluble.
 
Ah oui, soluble ne veut pas forcement dire active non plus (probleme de conformations).

j ai du SDs dans mon tampon pour remplit la cuve d electro

 
dans mon cas on dit que si la proteine est soluble y a de grande chance pour qu elle soit active

j ai pas encore fait le cours mais les proteines presente dans le cytoplasme par exemple est ce qu elle peuvent passer a travers la membrane si celle ci est bcp moins permeable et est ce que la chleur peut la rendre moins permeable?

Tu ne te fous pas un peu de nous? Tu travailles sur la toxine botulique et tu n'as aucune experience?  
 
De plus la chaleur telle qu'elle est decrite dans ton protocole ne lyse pas les bacteries, c'est pour denaturer les proteines avant electrophorese.
 
Il manque toujours les etapes preliminaires...
(tu ne me feras pas croire que tu ramasses ta bacterie et que tu la centrifuges direct pour en extraire les proteines comme tu le fais dans ta premiere experience).

 
ben je fais une production avant de bacterie de 100 ml c tt

 
et j induit   la synthese de proteine mais tt ca c pas important moi ce que je voulais savoir c etait seulement l explication de chaque etapae du traitement des solution ce qu il y a vant c bon j ai compris ........

Bon vais me renseigner sur comment se produit la toxine botulique et je reviens

 
je veux pas savoir comment elle est produite , je voulais juste savoir l expliocation de mon protocole

 
Ouais, ca j'ai compris... Maintenant ton protocole depend de ce que tu veux analyser, hein?
 
D'ailleurs je ne resiste pas a filer ceci (rapport tres eloigne avec le topic ):
 
 

 
 
D'ailleurs ce n'est pas si eloigne que cela puisque cela repond probablement en partie a ta question.

 
laisse tomber tu comprends pas ce que je veux

 
Oui moi aussi ca m'etonne la chaleur, doit yavoir aut chose...
 
Faut qu'il pense a mettre des gants c'est tout et a pas eternuer dans ca culture.

 
il faut qu elle pense et oui je suis une demoiselle
ben alors c koi qui lyse ma cellule si c pas la chaleur?

 
rien dans la premiere et peut etre ton byg buster dans la seconde.
Mais bon, comme je ne comprends pas ce que tu veux

 
lol te vexes pas
mais comment alors je peux voir si j ai des proteines si j ai pas de lyce de ma cellule a la premiere?